聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物是指通過(guò)特定的引物和酶在模板DNA上進(jìn)行擴(kuò)增的DNA片段。這種產(chǎn)物是特定的DNA序列的拷貝，通常由一對(duì)引物指導(dǎo)DNA聚合酶沿模板DNA合成。具有廣泛的生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值，且其純化和分析需要考慮多種因素以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。
PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法：
一、瓊脂糖凝膠電泳
這是實(shí)驗(yàn)室zui 常用的方法，簡(jiǎn)便易行，只需少量DNA即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其原理是不同大小的DNA分子通過(guò)瓊脂糖凝膠時(shí)，由于泳動(dòng)速度不同而被分離，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子發(fā)出熒光而判定其分子的大小。
用于電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖濃度常為1%—2%，應(yīng)該使用純度高的電泳純級(jí)瓊脂糖，這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質(zhì)。
（1）制膠
瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過(guò)薄則加樣孔樣品會(huì)溢出來(lái)，過(guò)厚觀察時(shí)熒光穿透不強(qiáng)以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配制2%凝膠100ml，稱取瓊脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液，微波爐加熱2-5min，使瓊脂糖wan 全溶解（注意不要暴沸），置室溫等溫度下降至60℃時(shí)，加入終濃度0.5μg/ml的EB液，充分混勻后倒板（注意排除氣體）。
（2）加樣和電泳
上樣時(shí)一般取PCR反應(yīng)液5~10μl，加入3μl溴酚蘭液，充分混勻，加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩(wěn)壓可調(diào)中壓電泳儀，電泳工作液為0.5×TBE液，接通電源，使樣品由負(fù)極向正極移動(dòng)。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。
（3）檢測(cè)
將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)，DNA產(chǎn)物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復(fù)合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現(xiàn)，并與擴(kuò)增時(shí)所設(shè)的陽(yáng)性對(duì)照比較，判斷陽(yáng)性或陰性結(jié)果。也可在電泳時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)分子量作對(duì)照，判斷其擴(kuò)增片段是否與設(shè)計(jì)的大小相一致。
PCR擴(kuò)增后一般進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳后一般有以下幾種條帶：
1、引物帶。引物濃度過(guò)高或是擴(kuò)增效率不是特別高時(shí)都會(huì)有，一般不呈現(xiàn)為細(xì)帶，為發(fā)散狀；如果目的擴(kuò)增產(chǎn)物帶和引物帶都很亮，可以考慮適當(dāng)降低引物量。
2、引物二聚體帶。比引物跑得慢一點(diǎn)，條帶清晰，但如果擴(kuò)增產(chǎn)物小于100bp時(shí)，產(chǎn)物與引物二聚體就不好分別了，建議采用DNA聚丙烯酰胺電泳（不是蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺電泳）；如果引物二聚體在優(yōu)化復(fù)性溫度后仍然嚴(yán)重影響目的產(chǎn)物的擴(kuò)增，優(yōu)先考慮更換引物設(shè)計(jì)（因?yàn)橐锖铣傻某杀颈确磸?fù)優(yōu)化條件的成本低）
3、目的擴(kuò)增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計(jì)大小相同，條帶清晰。
4、非特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計(jì)大小不相同，條帶清晰。一般考慮通過(guò)提高復(fù)性溫度來(lái)減少或消除（也可用溫度梯度功能來(lái)尋找zui佳的復(fù)性溫度，東勝龍811型PCR儀就有此功能）。如果其片段大小比目的片段大較多，可以通過(guò)減少延伸時(shí)間來(lái)減少或消除（即不給它足夠的延伸時(shí)間）。還有一種非特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶是來(lái)自于逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)的基因組DNA的污染，如果目的擴(kuò)增產(chǎn)物中有內(nèi)含子，擴(kuò)增產(chǎn)物很可能大于目的基因。這種條帶通過(guò)優(yōu)化復(fù)性溫度是不能消除的，可以在逆轉(zhuǎn)錄前用無(wú)RNA酶的DNA酶進(jìn)行樣本處理。
5、模板DNA帶。模板濃度過(guò)高時(shí)可能出現(xiàn)。如果是基因組DNA為模板，條帶可能會(huì)很亂且較大。一般進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，模板濃度都不要太大，否則會(huì)產(chǎn)生一些比目的基因長(zhǎng)一點(diǎn)的雜質(zhì)DNA（可能不成條帶，也看不到），這是由PCR擴(kuò)增原理造成的。
二、聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣，但在引物純化、PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析時(shí)常用到。
聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍：
(1)制膠
在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片，放上制膠架，擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。
制備適量合適濃度的凝膠，使之略多于膠板。
不同濃度（%）聚丙酰胺凝膠的制法：
在加入TEMED和10%過(guò)硫酸銨后，立即混勻，倒入放置45℃角的玻璃板內(nèi)，wan 全注滿（注意不要有氣泡），迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔頂并夾緊，待30-60分鐘膠聚合后，取下膠板，放入電泳槽中固定。
（2）加樣和電泳
上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液，溢過(guò)加樣孔，拔出梳子，排出加樣孔中的氣泡，將PCR產(chǎn)物或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物2與1上樣緩沖液混勻，用微量注射器加入加樣孔底部，使樣品在孔底成一層，兩側(cè)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)分子量的DNA Marker。
以2-10V/cm電壓電泳，電泳時(shí)間足夠長(zhǎng)，使片斷足以分開，待指示劑走到適宜位置時(shí)關(guān)閉電源，將膠片取出。
（3）銀染
分開兩塊玻璃板，將凝膠片放入100ml銀染固定液中振蕩15min，雙蒸水洗3次，每次2min，然后將凝膠片轉(zhuǎn)入100ml 0.2%的AgNO3中于搖床上染色約10min，吸去AgNO3液，用雙蒸水洗3次，每次30s，加入100ml顯色液約7-10min，待DNA帶顯示清除時(shí)，吸去顯色液，加入固定液Na2CO3，靜置2-3min，取出凝膠觀察。
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